HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南:稀釋作用
對于配制包含緩沖液和有機溶劑的流動相,有幾種方式可選。
對于等度工作,流動相可以手動混合,通過泵將其從單個容器中取用。
或者,使用HPLC系統混合組分。
濃縮的緩沖液可與純有機溶劑混合,或者將稀釋的緩沖液與含有相同濃度緩沖液的有機溶劑混合。
如果采用梯度洗脫法,只能使用最后兩種技術(在等度或梯度系統中,A和/或B溶劑可以是水/有機混合物)。
每種混合技術各有利弊。由于手動混合法可以觀察混合物的澄清度,并且能在使用前進行過濾,以去除沉淀,因此使HPLC系統出現緩沖液沉淀的可能性最小。
在線式混合方便等度方法的開發,并且也是梯度洗脫所必需的。
水狀緩沖液與純有機溶劑的混合十分簡單,但存在兩個潛在問題。首先,由于緩沖液被有機溶劑所稀釋,所以A-溶劑的緩沖液濃度必須高于流動相所需的緩沖液濃度;其次,會存在緩沖液濃度反向梯度的情況。在緩沖液和有機溶劑最初于混合器中接觸時,緩沖液濃度越高,越有可能產生沉淀。
在前述例子中,含有10mM磷酸鉀且pH為7.0的60%的ACN可溶于本體溶液中,但A容器將需要25mM磷酸鹽。當25mM磷酸鹽在混合器中接觸100%的ACN時,可能會產生沉淀。
混合上述溶劑的另一種方法是:將10mM的磷酸鹽放入A容器中。對于B-溶劑,手動混合70%的ACN和30%的含有33mM磷酸鹽的緩沖液,從而制備含有10mM磷酸鹽的70%ACN(表3臨界濃度的一半)。現在可以混合
A-和B-溶劑,從而獲得60%ACN,其最終濃度將含有10mM的磷酸鹽。
該技術可有效避免HPLC內部出現緩沖液沉淀的情況,并且可利用在線式混合方法,任意混合70%或更少ACN的流動相。
同時,緩沖液的濃度在整個梯度內恒定,所以在梯度過程中無需考慮緩沖液的稀釋,使梯度洗脫更具優勢。