通過RP-HPLC分析和純化蛋白以及多肽

賀文君

RP-HPLC在蛋白質研究中占據了非常重要的位置，用途廣泛，檢測的靈敏度高以及可以串聯質譜，可以用于分離結構非常相似的蛋白以及多肽類成分.

蛋白以及多肽在反相中的分離機制主要是吸附和解吸附的一個過程。

在反相HPLC中，顆粒表面是十分疏水的，通過疏水表面對蛋白質的一面（被稱為“疏水足”）吸附，蛋白質被保留下來。

與疏水表面的厚度相比，蛋白質要大得多，因此蛋白質僅有一部分被疏水表面所吸附。

大部分蛋白質位于表面上方與流動相接觸（蛋白質的大部分是在疏水面之上與流動相接觸）。

由這種疏水性吸附所導致的凈相互作用非常強，會導致蛋白質保持吸附在表面上直至接觸到特定濃度的有機溶劑，這時蛋白質會從表面上解吸附并從色譜柱上洗脫

色譜柱的考量：

1，超純超惰性硅膠對于蛋白多肽化合物的峰形至關重要。硅膠的純度，高純度的硅膠在多肽以及蛋白的分析中，即便在非常低濃度的離子對試劑中都能獲得極佳的峰形和分辨率。

超惰性硅膠柱往往需要極少量TFA也可獲得不錯的峰形，這點對LC-MS很有利。

2，色譜柱的長度方面，色譜柱的長度對于多肽分離而言不是一個重要的影響參數，色譜柱的長度對于多肽以及蛋白水解產物會有更大的影響。

為減小分析時間，短柱可以做為首先考慮。對蛋白分析而言，因為洗脫機理的原因，長短柱對分離度并不會有什么明顯影響，這點和化學小分子完全不同。

但是對于小分子多肽，往往長柱比短柱的分離度大，這點類似化學小分子。

3，色譜柱的內徑，標準的HPLC色譜柱的內徑一般是 4.6mm. 相對于標準的分析柱內徑而言，窄的內徑會有更高的靈敏度。

4，對于色譜柱固定相的選擇方面，ACT公司推出了生物分析方法開發包，主要提供三種固定相，C18-300, C4-300,Phenyl-300，提供三種不同的分離選擇性作為主流用柱。

另外，對于大分子蛋白的反相用柱選擇還有C8-300, CN-300作為補充選擇用柱。

流動相的考量：

1，有機相的選擇：

乙腈：廣泛用于反相色譜中分析聚合多肽。易揮發且洗脫能力強低的粘度和低的背壓比較透明，所以紫外吸收弱有很長的使用歷史。

異丙醇：很少用作單獨的流動相，因為粘度比較高。主要作為一種添加劑，一般添加濃度為1~5%，用于洗脫強疏水性的蛋白或多肽。

其他的流動相：甲醇或乙醇很少用于疏水性的蛋白質分析，由于乙醇的低毒性，常用于純化蛋白質。

2，梯度洗脫：一般情況下，梯度變化的越慢，分辨率越高。

在分析時間變化不大的前提下，通過調節梯度變化來優化條件是非常有意義的，但是也有相反的情況。

在RP-HPLC中，蛋白和多肽的保留和一般的小分子化合物有所不同，等度洗脫對于蛋白質的分離作用很小，有機相比例小的變化會引起蛋白質保留的大的變化。

3，離子對試劑，在PR-HPLC分析蛋白或者多肽的過程中，為了獲得更好的峰形，通常會在流動相中加入一些離子對試劑。

三氟乙酸：使用最廣泛，在分析得到的峰形相似的情況下，硅膠純度越高，使用的離子對試劑濃度可以相對更低。

其他可供選擇的離子對試劑：磷酸和七氟丁酸也會用于蛋白和多肽的分離。

4，pH對多肽保留的影響：在反相色譜中， 多肽的分離一般在酸性環境下進行。

在低的pH值條件下，多肽中的端基羧基以及側鏈的天冬氨酸和谷氨酸會質子化，從而增強保留。

反之，在堿性或中性條件下，會離子化，疏水作用降低，保留減弱。

溫度的影響:

柱溫以及流動相的溫度從兩方面影響多肽的分離：

溫度升高，保留時間會有一定程度的降低；

溫度升高會對多肽分離的選擇性有一定程度的影響，因此選擇適當的溫度，對多肽分離，尤其是肽圖分析顯得尤為重要。