層析柱是層析技術中的主體,一般用玻璃管或有機玻璃管。
根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同,從而分離的一種層析法。
選柱子:有玻璃柱和不銹鋼柱兩種,實驗室常用玻璃柱。徑高比一般在1:5-10。
根據吸附劑用量(體積)確定柱子大小,一般吸附劑應填充到柱子體積的1/4-1/5。
灌柱子方法
柱子可以分為:加壓,常壓,減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度,減少產品收集的時間,但是會減低柱子的塔板數。
其他條件相同的時候,常壓柱是效率最高的,但是時間也最長,比如天然化合物的分離,一個柱子幾個月也是有的。 減壓柱能夠減少硅膠的使用量,感覺能夠節省一半甚至更多,但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(有時在柱子外面有水汽凝結),以及有些比較易分解的東西可能得不到,而且還必須同時使用水泵抽氣(很大的噪音,而且時間長)。 加壓柱是種比較好的方法,與常壓柱類似,只是外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣,雙連球或小氣泵。
特別在容易分解的樣品的分離中適用。
壓力不可過大,不然溶劑走的太快就會減低分離效果。加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
柱子的尺寸為粗長的最好。柱子越長,相應的塔板數就越高。柱子越,上樣后樣品的原點就越小(反映在柱子上就是樣品層比較薄),這樣相對的減小了分離的難度。 無水無氧柱適用于對氧、水敏感,易分解的產品。可以濕柱,也可以干柱。
不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次,因為溶劑和硅膠飽和時放出的熱量有可能使產品分解,畢竟要分離的是敏感的物質,小心不為過。因為分離的物質比較敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。
至于是加壓、常壓、減壓,隨需而定。因為是schlenk操作,所以點板是個問題,如果樣品是顯色的,恭喜了,不用點板,直接看柱子上的色帶就行了。
如果樣品無色,只好準備幾十個schlenk瓶,一瓶一瓶的點,不過幾次之后就知道樣品在哪,也就可以省些了。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。
因為硅膠中有大量的羥基裸露在外,很容易是樣品分解,特別是金屬有機化合物和含磷化合物。
而氧化鋁有堿性、中性和酸性的,選擇余地比較大,但比硅膠要貴些。
聽說有個方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產品在哪里了,沒有驗證過。
選擇吸附劑:200-300目硅膠,稱30-70倍于上樣量;如果極難分,也可以用100倍量的硅膠。
干硅膠的視密度在0.4左右,所以要稱40g硅膠,用燒杯量100ml也可以。
推薦硅膠量是樣品量的30-40倍,具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開(是指在所需組分Rf在0.2-0.4,雜質相差0.1以上),就可以少用硅膠。 用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。
所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話,就不容易流出。這樣就會發生,后面的點先出,而前面的點后出。
這時可以采用氧化鋁作固定相。
常用吸附劑的種類:氧化鋁、硅膠、聚酰胺、硅酸鎂、滑石粉、氧化鈣(鎂)、淀粉、纖維素、蔗糖和活性炭等。 (1)氧化鋁:市售層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三類,粒度規格大多為100-150目。
堿性氧化鋁(pH9—10):適用于堿性物質(如胺、生物堿)和對酸敏感的樣品(如縮醛、糖苷等),也適用于烴類、甾體化合物等中性物質的分離。
但這種吸附劑能引起被吸附的醛、酮的縮合。酯和內酯的水解、醇羥基的脫水、乙酰糖的去乙酰化、維生素A和K等的破壞等不良副反應。所以,這些化合物不宜用堿性氧化鋁分離。
酸性氧化鋁(pH3.5—4.5):適用于酸性物質如有機酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。
中性氧化鋁(pH7—7.5):適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質中不穩定的物質如酯、內酯等的分離,也可以用來分離弱的有機酸和堿等。
(2)硅膠:硅膠是硅酸的部分脫水后的產物,其成分是SiO2·xH2O,又叫縮水硅酸。柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。
適用范圍:非極性和極性化合物,適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸,及一系列合成產品如有機金屬化合物等。
(3)聚酰胺:色譜用聚酰胺主要有錦綸6(聚己內酰胺)和錦綸66(聚己二酰己二胺)兩種,分子量一般在16000-20000,其親水性和親脂性均較好,因此既可分離水溶性成份,也可分離脂溶性成分。
可溶于濃鹽酸、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中;微溶于乙酸和苯酚等;不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等;對堿穩定,對強酸可水解。
分
離對象:能與聚酰胺形成氫鍵的化合物,如酚類、酸類、醌類、硝基化合物及含羥基、氨基、亞氨基的化合物及腈和醛等類化合物。
形成氫鍵的基團(如酚經基、按基、酪基、硝基等)越多,吸附力越強。
如丁二酸>丁酸 形成氫鍵的位置與吸附力有很大關系。對位、間位酚羥基使吸附力增大,鄰位使吸附力減小。
芳香核、共軛雙鍵多者吸附力大,少者吸附力小。若形成分子內氫鍵,則使化合物的吸附力減小。
(4)硅酸鎂:中性硅酸鎂的吸附特性介于氧化鋁和硅膠之間,主要用于分離甾體化合物和某些糖類衍生物。
為了得到中性硅酸鎂,用前先用稀鹽酸,然后用醋酸洗滌,最后用甲醇和蒸餾水徹底洗滌至中性。
柱層析的裝柱非常重要,裝柱的效果會直接影響層析分離效果。
有濕法裝柱和干法裝柱等兩種方法。濕法裝柱很簡單,使用也最普遍, 就是先用比固定相多一倍的洗脫劑將固定相活成勻漿,柱子底部先用脫脂棉塞緊, 然后倒入洗脫劑將脫脂棉中氣泡趕出。
用漏斗將活好的固定相倒入柱子中, 打開底部活塞, 將柱子中高出固定相的溶劑放出。
期間不斷用橡皮棒敲打, 將固定相敲實, 做到密實均勻無氣泡即可。
很多時候用加壓的方法可以很高效地裝好柱子,而且在柱子中沒有氣泡產生。
干法裝柱與濕法裝柱剛好相反的是,它是將干燥的吸附劑從柱子上端直接加入到一個空的柱子中, 然后用油泵抽柱子底部, 相當于減壓過柱, 直到柱子變得很結實, 再用淋洗劑“走柱子” 。干法裝柱的一個缺點就是在裝入洗脫劑后, 由于溶劑和固定相之間的吸附放熱, 所以柱子容易變花,影響分離效果。(2)一定要用較多的溶劑“走柱子”,直到柱子的下端不再發燙, 恢復到室溫后再撤去壓力。無論使用哪種方法裝柱,最后都要求所裝的柱子結實、勻稱、無氣泡。上樣也有濕法和干法之分:濕法一般用淋洗劑溶解樣品, 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等, 但溶劑越少越好。
再用膠頭滴管轉移得到的溶液,沿著層析柱內壁緩慢地均勻加入。
在不用海沙的情況下, 盡量不要破壞硅膠面。加樣后, 打開柱底活塞, 讓固定相充分地吸附所加樣品。然后再加入一些洗脫劑,再充分地吸附后將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑, 而不會沖壞硅膠表面。很多樣品在上柱前是粘乎乎的, 一般沒關系。
有的時候上樣后在硅膠上又會析出,這一般都是比較大量的樣品才會出現, 是因為硅膠對樣品的吸附飽和, 而樣品本身又是比較好的固體才會析出, 這就需要先重結晶樣品, 得到大部分的產品后剩余的產品再柱分。
如果不能重結晶也沒關系,直接過柱就行, 樣品會隨著淋洗劑流動而慢慢溶解, 最后隨著洗脫劑流出。
有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑又不能上柱(比如 DMF,DMSO等, 會隨著溶劑一起走, 顯色是一個很長的脫尾) , 這時就必須用干法上柱了。
干法過柱是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后,在加入少量硅膠, 拌勻后再旋去溶劑。
一般樣品和硅膠按 1:1 的量混合, 硅膠使用的量也可以少一些, 但是要保證在旋干后, 不能看到明顯的固體顆粒,讓樣品都吸附在硅膠的表面上。然后小心地加入到裝好的柱子中, 加入洗脫劑洗脫。
柱層析按過柱時的壓力可以分為:加壓, 常壓, 減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度, 減少產品收集的時間, 但是會減低柱子的塔板數。
所以其他條件相同的時候,常壓柱是效率最高的, 但是時間也最長, 例如一些天然化合物的分離,有時一個柱子過幾個月也有可能。
減壓柱能夠減少硅膠的使用量,但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發, 有時會在柱子外面有水汽凝結, 另外有些比較易分解的東西可能得不到, 而且還必須同時使用水泵抽氣, 噪音大, 時間長, 所以減壓過柱用得比較少。
加壓過柱是一種比較好的方法, 與常壓柱類似, 但用外加壓力可以使淋洗劑走的快些。
壓力的提供可以是壓縮空氣,雙連球或者小氣泵 (用魚缸供氣的加壓泵就行)。特別是在容易分解的樣品的分離中很適用。
一般壓力不可過大,不然溶劑走的太快就會減低分離效果。
因為加壓過柱效率高, 分離效果較好, 所以加壓過柱在普通的有機化合物的分離中是非常適用的。
一些低沸點溶劑裝柱時往往會在柱子中產生氣泡, 使柱子變花, 利用加壓過柱法在裝柱時就可以有效地解決這個問題, 而且可以使柱子很快裝實。隨著科技的發展, 色譜法的技術也日新月異, 但柱層析實驗技術還是比較簡單和實用的, 每個科研工作者在使用柱層析時, 可以根據自己的實際情況來不斷地摸索,不斷地總結和提高柱層析的實驗技術。