做液相色譜的同學都知道,液相色譜分離條件中,最重要的參數就是洗脫條件,其中分離條件又分為等度洗脫和梯度洗脫。
等度洗脫
是指在樣品組分的分析周期中,流動相的組成比例和流速恒定不變的洗脫方式。
梯度洗脫
是指在同一個分析周期中,按一定程度不斷改變流動相的濃度配比的洗脫方式。
在色譜分析時,等度洗脫和梯度洗脫各有優勢和劣勢。
優點
?對于等度洗脫而言,由于方法運行時,流動相的比例不發生變化,所以它對儀器的要求不高,只需要一個單元泵就可以運行方法。
?其次,由于等度洗脫條件單一,所以比較容易用來摸索方法設置,例如改變流動相比例,改變柱溫等條件。
?并且由于等度洗脫每次運行時的流動相比例相同,所以相同方法運行多個樣品時,樣品之間不需要設置平衡時間來讓系統恢復到所需的流動相比例。
缺點
?但是它也有缺點,那就是越往后出峰的組分色譜峰越寬。
?并且大多數等度洗脫的方法分析時間較長。
等度洗脫
優點
?而梯度洗脫能夠規避掉等度洗脫的問題,例如梯度洗脫的樣品峰,無論先出峰還是后出峰的組分,它們的峰形基本都能保證尖銳對稱。
?其次由于梯度洗脫通常設置的流動相比例是讓洗脫強度越來越強,這樣能保證在較短的時間內,讓樣品中強保留組分也能被洗脫出來。
缺點
?但是伴隨著這些優點也會有對應的缺點,首先它對儀器的配置要求較高,通常需要配置四元泵或者二元泵。
?其次它在每次運行樣品之間,需要設置一定的平衡時間,來讓系統中流動相的比例到達初始流動相比例。
?最后,由于它的方法設置復雜,例如影響分離的有初始流動相比例、流動相的梯度變化、結束流動相比例、柱溫箱溫度等,所以方法的開發和優化會較為復雜。
梯度洗脫
了解了這么多等度洗脫和梯度洗脫的優缺點,很多同學可能會有疑問,我如何知道我的樣品適合等度洗脫還是梯度洗脫呢?
不用著急,這是有規律可循的。
對于常規樣品而言,建議大家在初始設置方法時可以先參考以下初始條件運行:
20分鐘內,將有機相比例從5-10%線性升高至100%,并保持一段時間以保證所有組分被洗脫出來。
如果在梯度結束后,有組分的洗脫時間超過梯度時間的25%,也就是該條件中如果有化合物在25分鐘之后被洗脫出來,則需要考慮更換保留能力更弱的色譜柱或更換極性更強的有機溶劑。
我們可以看出 ΔtG>0.25 tG,所以該方法不適合等度洗脫。
適合等度洗脫的方法要求 ΔtG<0.25tG。
如果你的方法適合等度洗脫,那么又該如何設置呢?
tr(avg)=(ti+tf)/2=17min
Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min
等度洗脫流動相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B
綜上所述,如果該樣品可以用等度洗脫,那么方法設置為:水相與有機相比例為14:86,保持17min。
梯度洗脫如何設置
如果該樣品需要做梯度洗脫,方法參數又該如何設置呢?
梯度洗脫主要包括以下幾個參數:初始流動相比例、結束流動相比例和流動相變化速率,同樣以之前的樣品為例:
Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min
調整后的初始流動相比例
Optimized%Binitial
=(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B
=(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10
=42.67%B
調整后的結束流動相比例
Optimized%Bfinal
=(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B
=(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10
=82.36%B
通過計算得到調整后的初始流動相比例等于42.67%,調整后的結束流動相比例等于82.36%。