高效液相色譜中，分離度是判斷物質分離情況的重要指標，它通常用R表示，計算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)。

其中，tR2和tR1分別為相鄰兩個色譜峰的保留時間，W1和W2分別為相鄰兩個色譜峰的峰寬。

當R=1時，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。當R=1.5時，分離度可達99.7%。通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。

同時，分離度還可以判斷分離物質對色譜柱在色譜柱中的分離情況，一般用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。