PITC 衍生法分析 18 種氨基酸
方法:適用于 ChP. 2015 二部中《復方氨基酸注射液中氨基酸的測定》氨基酸分析步驟
1. 原理
這種分析氨基酸的方法基于柱前衍生步驟,衍生化反應是在堿性條件下完成的,采用異硫氰酸苯酯和游離氨基酸反應生成的 PTC-氨基酸衍生物可于 UV 254nm 處被檢測到。通過 PITC 衍生法改善的氨基酸分離,同樣使其分析更有效。
圖 1. PITC 氨基酸衍生原理
2. 試劑
三乙胺溶液:將 1.4mL 1mol/L 三乙胺溶液和 8.6mL 乙腈混合均勻;
異硫氰酸苯酯溶液:配成 12.5μL/mL 的異硫氰酸苯酯的乙腈溶液(即 0.1mol/L);
18 種氨基酸標準溶液:溶解或稀釋一定量的 18 種氨基酸于 0.1mol/L 鹽酸中,配制成 0.5μmol/mL 的 18
種氨基酸標準溶液。
3. 衍生化
轉移 200μL 的 18 種氨基酸標準溶液(或樣品溶液)入 1.5mL 塑料管中,加入 100μL 三乙胺溶液和 100μL 異硫氰酸苯酯溶液,混合,至于室溫下反應 1h 后,加入 400μL 正己烷,渦旋振蕩 10min。取澄清的下層液,稀釋三倍后,用 0.45μm 濾膜過濾后進樣。
4. 液相色譜分析
色譜柱:ACE Excel SuperC18 5μm 250×4.6mm(貨號:EXL-1211-2546U)
流動相:A:0.1mol/L 醋酸鈉溶液(用稀醋酸調節 pH 值至 6.5)-乙腈(93:7) B:乙腈-水(80:20)
流速:1ml/min
時間(min)
流動相 A(%)
流動相 B(%)
0
100
0
15
85
15
18
76
24
25
60
40
30
60
40
30.01
0
100
50
0
100
50.01
100
0
70
100
0
進樣體積: 5μl 檢測波長:254nm 柱溫:36℃
注:這里梯度供參考,可根據儀器實際情況進行適當調整
1. ASP,天冬氨酸;2. Glu,谷氨酸;3. Ser,絲氨酸;4. Gly,甘氨酸;5. His,組氨酸;
6. Arg,精氨酸;7. Thr,蘇氨酸;8. Ala,丙氨酸;9. Pro,脯氨酸;10. Tyr,酪氨酸;
11. Val,纈氨酸;12. Met,甲硫氨酸;13. Cys,胱氨酸;14. Ile,異亮氨酸;
15. Leu,亮氨酸;16. Phe,苯丙氨酸;17. Trp,色氨酸;18. Lys,賴氨酸。