靈敏的檢測 - 蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南
利用反相高效液相色譜法分離多肽時,通常通過在214-215 nm波長附近的紫外吸收檢測。
肽鍵在這一波長范圍內吸收較好,為各類型多肽提供最靈敏的檢測。
采用短波紫外波段檢測的一個問題是流動相的吸收。
在波長215 nm處,乙腈不吸收紫外光,但TFA會略有吸收。
在梯度洗脫期間,增加有機溶劑的濃度會使溶液的介電常數發生改變,這將引起TFA在短波紫外波段吸收光譜的變化。
這一吸光度變化會導致基線上飄,如圖21所示。在需要靈敏檢測時尤其明顯。
在示例中,多肽圖譜經常顯示出基線飄高(圖22)。避免基線漂移的常見做法是降低有機溶劑中TFA的濃度(相對于水溶性溶劑)。
如果在水溶性溶劑中加入0.1%的TFA,則在有機溶劑中加入0.08-0.09%的TFA。這將使多肽圖譜中的基線趨平。
圖21. 梯度洗脫期間,增加乙腈的濃度會改變流動相的介電常數,從而由于TFA吸收光譜的變化導致基線飄高。
圖22. 隨著有機溶劑濃度的增加,TFA吸收率變化可能引起多肽圖譜中基線的漂移。